Dekonvolution mit Huygens2
Durch die optischen Eigenschaften wird eine punktförmige Lichtquelle nicht als Punkt abgebildet, sondern als mehr oder weniger scharfe dreidimensionale Struktur (eine Art "Wolke"), die eine bestimmte Helligkeitsverteilung aufweist. Die "Point spread function" (PSF) gibt das reale Abbid einer (theoretisch) punktfoermigen Lichtquelle. Kennt man diese PSF, dann kann man einigermassen genau von einem durch das Mikroskop erhaltenen Abbild des Objektes auf die urspruengliche Verteilung der "Lichtquellen" (z.B. Fluorochrome) im Objekt (z.B. in einer Zelle) rückschliessen.
Die reale PSF des Mikroskops/Objektivs kann man mit fluoreszierenden Beads, deren Eigenschaften (Durchmesser, Fluoreszenzmarkierung, Fluoreszenzverteilung) man kennt, einigermassen genau ermitteln. Die PSF ist abhängig von verschiedenen mikroskopischen Parametern (Typ, Fabrikat, Justierung, Objektiv, numerische Apertur, Brechungsindex des Immersionsmediums etc).
Ermittlung der PSF aus gemittelten Beads
- Beads auf Deckglas bringen und einbetten in Medium mit bekanntem Brechungsindex (vgl. Tabelle Brechungsindex)
- Beads scannen: Nyquist-Kriterium beachten: Voxelsize der numerischen Apertur und dem Brechungsindex anpassen: Web-Calculator von SVI
- Beads mitteln (average sphere): zuerst Files der Beads laden, Parameter korrigieren laut Aufnahmeparametern (*.exp-File). Funktion average sphere
- Beads evtl. spiegeln
- Object model erstellen (Sphere mit Radius der Beads)
- PSF erstellen aus gemittelten Beads
Dekonvolution
- LEICA-Scannerfiles (*.tif) und die zugehoerigen PSFs in neues Directory bringen
- Huygens starten
- PSFs laden
- LEICA-Scannerfile laden
- Parameter aus Exportfile übernehmen; ggf. Berechnung der Pinhole Size aus dem digitalen Wert im *.exp-File des Scans
- evtl. Kanäle splitten
- Dekonvolution starten (evtl. mit chop.tcl-Skript)
Berechnung der Pinhole-Grösse
Formel: siehe Huygens2 Anleitung von SVI